MINISTARSTVO POLJOPRIVREDE, RIBARSTVA I RURALNOG RAZVOJA

4188

Na temelju članka 73. stavka 5. Zakona o veterinarstvu (»Narodne novine«, broj 41/07) ministar poljoprivrede, ribarstva i ruralnog razvoja donosi

PRAVILNIK

O VETERINARSKIM UVJETIMA ZA PREMJEŠTANJE KOPITARA I UVOZ IZ TREĆIH ZEMALJA[1]

Poglavlje I.
OPĆE ODREDBE

Članak 1.

Ovim se Pravilnikom utvrđuju veterinarsko-zdravstveni uvjeti za premještanje živih kopitara između Republike Hrvatske i država članica Europske unije te uvoz živih kopitara iz trećih zemalja.

Članak 2.

Za potrebe ovoga Pravilnika pojedini pojmovi imaju sljedeće značenje:

(a) »gospodarstvo« je poljoprivredni ili sportski objekt, staja ili svaki prostor ili objekt u kojemu se kopitari drže ili uzgajaju, bez obzira na namjenu;

(b) »kopitari« su divlje ili domaće životinje koje pripadaju vrstama konja (uključujući zebre) ili magaraca ili njihovi križanci;

(c) »registrirani kopitari« su svi registrirani kopitari u skladu s posebnim propisom[2], koje prati identifikacijski dokument koji je izdala uzgojna organizacija ili nadležno tijelo države iz koje potječe životinja, a koje vodi matičnu knjigu ili upisnik za određenu pasminu, odnosno međunarodno udruženje ili organizacija koja se bavi konjima za natjecanje ili trkaćim konjima;

(d) »kopitari za klanje« su kopitari koji se prevoze u klaonicu radi klanja, bilo izravno, bilo preko sajma ili sabirnog centra;

(e) »kopitari za uzgoj i rasplod« su kopitari koji nisu navedeni u točkama (c) i (d) ovoga članka;

(f) »država članica Europske unije (u daljnjem tekstu: država članica) ili treća zemlja slobodna od konjske kuge« je bilo koja država članica ili treća zemlja u kojoj nije bilo kliničkih, seroloških (kod necijepljenih kopitara) ili epidemioloških dokaza o konjskoj kugi u posljednje dvije godine i u kojoj se u posljednjih 12 mjeseci nije provodilo cijepljenje protiv te bolesti;

(g) »bolesti kopitara koje se obvezno prijavljuju« su bolesti koje su navedene u Dodatku A ovoga Pravilnika;

(h) »službeni veterinar« je veterinar kojeg imenuje ministar u skladu s odredbama Zakona o veterinarstvu;

(i) »privremeni boravak« je status registrirane životinje koja potječe iz treće zemlje, iz koje je dozvoljen uvoz na područje Republike Hrvatske u vremenskom razdoblju do 90 dana, ovisno o zdravstvenoj situaciji u državi podrijetla;

(j) »nadležno tijelo« je Ministarstvo poljoprivrede, ribarstva i ruralnog razvoja;

(k) »treće zemlje« su države koje nisu države članice.

Poglavlje II.
PREMJEŠTANJE KOPITARA

Članak 3.

1) Nadležno tijelo odobrava premještanje registriranih kopitara na području Republike Hrvatske odnosno otpremu kopitara u državu članicu kada kopitari ispunjavaju uvjete propisane člancima 4. i 5 ovoga Pravilnika.

2) Nadležno tijelo odobrava odstupanja koja se odnose na premještanje kopitara koji:

– se jašu ili vode, u sportske ili rekreacijske svrhe, uzduž cesta koje su smještene blizu granice Republike Hrvatske s državama članicama, a nakon pristupanja Republike Hrvatske u članstvo Europske unije, blizu unutarnjih granica Europske unije;

– sudjeluju u kulturnim ili sličnim događajima ili aktivnostima koje organizira ovlašteno lokalno tijelo, na granici Republike Hrvatske s državama članicama, a nakon pristupanja Republike Hrvatske u članstvo Europske unije, blizu unutarnjih granica Europske unije;

– se isključivo upućuju na privremenu ispašu ili rad blizu granice Republike Hrvatske s državama članicama, a nakon pristupanja Republike Hrvatske u članstvo Europske unije, blizu unutarnjih granica Europske unije.

3) Nadležno tijelo o odstupanjima iz stavka 2. ovoga članka te o sadržaju odstupanja obavještava Europsku komisiju.

Članak 4.

1) Veterinarsko-zdravstveni pregled kopitara koji se premještaju, mora se obaviti u razdoblju od 48 sati prije njihovog ukrcaja ili utovara. Kopitari pri pregledu ne smiju pokazivati kliničke znakove bolesti. Ukoliko se radi o registriranim kopitarima, pregled se obavlja samo za promet na području Republike Hrvatske, a nakon pristupanja Republike Hrvatske u članstvo Europske unije, za promet unutar Europske unije, ne dovodeći u pitanje odredbe članka 6. ovoga Pravilnika.

2) Ne dovodeći u pitanje uvjete propisane stavkom 5. ovoga članka koji se odnose na bolesti kopitara koje se obvezno prijavljuju, službeni veterinar mora za vrijeme pregleda i na temelju izjave vlasnika ili uzgajivača utvrditi nepostojanje razloga za sumnju da su kopitari bili tijekom 15 dana, neposredno prije pregleda u dodiru s kopitarima koji boluju od zaraznih ili kontagioznih bolesti.

3) Kopitari ne smiju biti namijenjeni klanju radi provođenje nacionalnog programa za iskorjenjivanje kontagioznih ili zaraznih bolesti.

4) Kopitari se identificiraju na sljedeći način:

– ako se radi o registriranim konjima, pomoću identifikacijske isprave u skladu s posebnim propisom[3], kojom se mora potvrditi sukladnost s člankom 5. i člankom 6. ovoga Pravilnika. Službeni veterinar privremeno stavlja izvan snage ispravu tijekom razdoblja zabrana propisanih stavkom 5. ovoga članka ili člankom 5. ovoga Pravilnika. Isprava se mora nakon klanja registriranog kopitara vratiti tijelu koje je ispravu izdalo;

– kopitari za uzgoj i proizvodnju identificiraju se sukladno važećim propisima.

5) Uz uvjete propisane člankom 5. ovoga Pravilnika, kopitari ne smiju dolaziti s gospodarstva na kojem su određene zabrane, kako slijedi:

(a) sve životinje koje pripadaju vrstama prijemljivim na bolest nisu zaklane, a razdoblje zabrane otpreme životinja za gospodarstvo s kojeg potječu mora iznositi najmanje:

– šest mjeseci u slučaju kopitara za koje se sumnja da su oboljeli od durine, računajući od datuma posljednjeg stvarnog ili mogućeg kontakta s bolesnom životinjom. U slučaju pastuha, navedena zabrana se primjenjuje do trenutka kastracije životinje,

– šest mjeseci u slučaju maleusa ili encefalomijelitisa konja, računajući od dana klanja kopitara oboljelih od navedenih bolesti,

– u slučaju infekciozne anemije kopitara, zabrana mora biti na snazi sve dok se ne zakolju sve zaražene životinje, a preostale životinje negativno reagiraju na dva Cogginsova testa izvedena u razmaku od tri mjeseca,

– šest mjeseci u slučaju vezikularnog stomatitisa,

– mjesec dana od zadnjega prijavljenog slučaja, ukoliko se radi o bjesnoći,

– 15 dana od zadnjega prijavljenog slučaja, ukoliko se radi o bedrenici;

(b) sve životinje koje pripadaju vrstama prijemljivim na bolest su zaklane i prostori dezinficirani. Razdoblje zabrane otpreme životinja iznosi 30 dana računajući od dana kada su životinje uništene te prostori dezinficirani, osim u slučaju bedrenice za koju razdoblje navedene zabrane iznosi 15 dana.

6) Nadležno tijelo može odobriti odstupanje od mjera zabrane iz stavka 5. ovoga članka za hipodrome i trkališta.

7) Nadležno tijelo o odstupanju iz stavka 6. ovoga članka i razlozima odstupanja obavještava Europsku komisiju.

8) Kada nadležno tijelo izrađuje ili je izradilo dobrovoljni ili obvezni program kontrole za bolesti na koju su kopitari prijemljivi, može navedeni program dostaviti Europskoj komisiji. Program sadržava sljedeće podatke:

– rasprostranjenost bolesti na području države,

– razloge za izradu programa, uzimajući u obzir značaj bolesti te vjerojatne prednosti programa u odnosu na troškove njegove provedbe,

– zemljopisno područje na kojem se program primjenjuje,

– različite kategorije u koje se raspoređuju objekti, standarde kojima s obzirom na vrstu moraju udovoljiti te postupke testiranja koji se primjenjuju,

– postupke praćenja programa,

– radnje koje se poduzimaju ako gospodarstvo iz bilo kojeg razloga izgubi status,

– mjere koje se poduzimaju ako su rezultati testiranja provedeni u skladu s programom pozitivni,

– nediskriminirajuće uvjete prometa na području Republike Hrvatske i u odnosu na promet unutar Europske unije.

Članak 5.

1) Ukoliko Republika Hrvatska nije slobodna od konjske kuge u skladu s člankom 2. točkom (f) ovoga Pravilnika, nadležno tijelo može odobriti otpremu kopitara iz dijela države koje se smatra zaraženim u skladu sa stavkom 2. ovoga članka, jedino pod uvjetima iz stavka 3. ovoga članka.

2(a) Dio područja se smatra zaraženim konjskom kugom ako:

– klinički, serološki (kod necijepljenih životinja) i/ili epidemiološki dokazi ukazuju na prisutnost konjske kuge u posljednje dvije godine, ili

– je u posljednjih 12 mjeseci provedeno cijepljenje protiv konjske kuge.

(b) Dio područja koji se smatra zaraženim konjskom kugom mora obvezno obuhvaćati sljedeće:

– zaraženo područje koje se proteže u krugu, promjera najmanje 100 km oko središta zaraze,

– ugroženo područje koje se proteže najmanje 50 km izvan zaraženog područja i u kojem u posljednjih 12 mjeseci nije provedeno cijepljenje.

(c) Mjere koje se provode na području iz točaka (a) i (b) ovoga stavka i odgovarajuća odstupanja propisana su Pravilnikom o mjerama kontrole i suzbijanja konjske kuge (»Narodne novine«, broj 112/08)[4];

(d) Svi cijepljeni kopitari koji se nalaze u zaraženom području moraju biti registrirani i označeni u skladu s člankom 6. stavkom 1. Pravilnika o mjerama kontrole i suzbijanja konjske kuge5. Cijepljenje mora biti jasno navedeno u identifikacijskoj ispravi i/ili certifikatu.

3) Kopitari se smiju otpremati iz područja navedenog u stavku 2. točki (b) ovoga članka, jedino ukoliko ispunjavaju sljedeće uvjete:

(a) tijekom određenih godišnjih razdoblja, ovisno o aktivnosti insekata koji prenose bolest;

(b) ako na dan pregleda iz članka 4. stavka 1. ovoga Pravilnika ne pokazuju kliničke simptome konjske kuge;

(c) i ukoliko:

– nisu cijepljeni protiv konjske kuge, moraju biti pretraženi na konjsku kugu imunoenzimnim testom (ELISA) kako je navedeno u Dodatku D ovoga Pravilnika, i to dvokratno u razmaku od 21 do 30 dana s negativnim rezultatom, pri čemu se drugo pretraživanje mora obaviti u razdoblju od 10 dana prije otpreme,

– su cijepljeni, cijepljenje je zabranjeno tijekom posljednja dva mjeseca, a životinje moraju biti podvrgnute imunoenzimnom testu (ELISA), kako je navedeno u Dodatku D ovoga Pravilnika i to u razmacima navedenim u alineji prvoj ove točke, u kojima ne pokazuju povećanje broja antitijela.

(d) najmanje 40 dana prije otpreme moraju provesti u karantenskom objektu;

(e) tijekom karantene te tijekom prijevoza iz karantenskog objekta do mjesta otpreme moraju biti zaštićeni od insekata koji prenose bolest.

Članak 6.

1) U slučaju primjene alternativnih sustava kontrole koji pružaju jamstva istovrijedna jamstvima iz članka 4. stavka 5. ovoga Pravilnika u odnosu na premještanja kopitara i registriranih kopitara unutar područja Republika Hrvatske i država članica, osobito na osnovi identifikacijskog dokumenta, države mogu jedna drugoj, na temelju uzajamnosti, odobriti odstupanje od odredbe iz članka 4. stavka 1. prve rečenice i članka 8. stavka 1. alineje druge ovoga Pravilnika.

2) U slučaju postupanja iz stavka 1. ovoga članka nadležno tijelo obavještava Europsku komisiju.

Članak 7.

1) Kopitari se prevoze s gospodarstva podrijetla na mjesto odredišta što je prije moguće, bilo izravno, bilo preko odobrenog sajma ili sabirnog centra u skladu s člankom 2. stavkom 2. točkom (o) posebnog[5] propisa[6] u vozilima ili spremnicima, koji se redovito čiste i dezinficiraju dezinficijensima u propisanim razmacima, u kojima se kopitari otpremaju. Vozila moraju biti izrađena na način da izmet, stelja ili hrana za životinje ne mogu ispadati iz vozila za vrijeme prijevoza. Prijevoz se mora obaviti na način da su zdravlje i dobrobit kopitara učinkovito zaštićeni.

2) Nadležno tijelo može odobriti odstupanja od pojedinih uvjeta iz članka 4. stavka 5. ovoga Pravilnika, za svaku životinju označenu posebnom oznakom koja pokazuje da je životinja namijenjena klanju uz uvjet da je odstupanje evidentirano u certifikatu. Ukoliko nadležno tijelo odobri odstupanje, kopitari za klanje prevoze se izravno u unaprijed određenu klaonicu i moraju biti zaklani unutar 5 dana od prispijeća u klaonicu.

3) Službeni veterinar mora upisati identifikacijski broj ili broj identifikacijskog dokumenta zaklane životinje te navedene podatke dostaviti nadležnom tijelu u mjestu iz kojeg su kopitari otpremljeni, a na njihov zahtjev dostavlja i potvrdu iz koje je vidljivo da su životinje zaklane.

Članak 8.

1) Nadležno tijelo osigurava da:

– ukoliko je registrirani kopitar namijenjen prometu unutar Republike Hrvatske, a danom pristupanja Republike Hrvatske Europskoj uniji prometu unutar područja država članica, kada napusti gospodarstvo kopitara mora pratiti identifikacijski dokument u skladu s člankom 4. stavkom 4. ovoga Pravilnika, uz izjavu iz Dodatka B ovoga Pravilnika,

– kopitare za uzgoj, rasplod i klanje tijekom prijevoza mora pratiti certifikat u skladu s Dodatkom C ovoga Pravilnika.

2) Certifikat, ili kada se radi o identifikacijskom dokumentu, obrazac koji sadrži podatke o zdravstvenom stanju mora, ne dovodeći u pitanje odredbu članka 6. ovoga Pravilnika, biti izdan u roku 48 sati prije utovara ili najkasnije posljednji radni dan prije utovara, na hrvatskom jeziku i najmanje jednom od službenih jezika Europske unije. Certifikat važi 10 dana i sastoji se od samo jednog lista.

3) U slučaju uvoza kopitara, osim registriranih, kopitare mora pratiti jedan certifikat po pošiljci umjesto pojedinačnog certifikata iz alineje druge stavka 1. ovoga članka.

Članak 9.

Na preglede obavljene na mjestu podrijetla i mjestu odredišta, organizaciju navedenih pregleda i mjere sigurnosti primjenjuju se odredbe Pravilnika o veterinarskim i zootehničkim pregledima određenih životinja i proizvoda u prometu s državama članicama Europske unije (»Narodne novine«, broj 147/08)[7].

Članak 10.

1) Stručnjaci Europske komisije mogu, u suradnji s nadležnim tijelom, u mjeri u kojoj je potrebno, radi utvrđivanja provedbe ovoga Pravilnika obaviti pregled na licu mjesta.

2) Nadležno tijelo osigurava svu potrebnu pomoć stručnjacima iz stavka 1. ovoga članka u obavljanju njihovog posla.

Poglavlje III.
UVOZ IZ TREĆIH ZEMALJA

Članak 11.

Pri uvozu kopitara iz trećih zemalja u Republiku Hrvatsku moraju biti ispunjeni uvjeti propisani člancima 12. do 16. ovoga Pravilnika.

Članak 12.

1) Uvoz kopitara iz trećih zemalja ili dijelova trećih zemalja u Republiku Hrvatsku je dozvoljen ako se treća zemlja nalazi na popisu koji sastavlja Europska komisija.

2) Uz popis iz stavka 1. ovoga članka potrebno je osobito uzeti u obzir:

(a) zdravstveni status kopitara, drugih domaćih životinja i divljači u trećim zemljama, te egzotične bolesti životinja i sve aspekte opće zdravstvene situacije i stanje u okolišu treće zemlje, koji mogu predstavljati rizik za zdravlje i stanje u okolišu u Republici Hrvatskoj i Europskoj uniji;

(b) važeće propise treće zemlje koji se primjenjuju u odnosu na zdravlje životinja i dobrobit;

(c) organizaciju nadležnog tijela za veterinarstvo i inspekcije treće zemlje, njihove ovlasti, nadzor koji se provodi nad njihovim radom, dostupnost javnosti, uključujući osoblje i laboratorijske kapacitete radi učinkovite primjene propisa odnosne zemlje;

(d) potvrdu koju nadležno tijelo treće zemlje izdaje u odnosu na jednakovrijednost postupanja sukladno odgovarajućim zahtjevima u odnosu na zdravlje životinja koji se primjenjuju u Europskoj uniji;

(e) ukoliko je treća zemlja istovremeno članica Svjetske organizacije za zdravlje životinja (u daljnjem tekstu: OIE), redovito i ažurno dostavljanje podataka u odnosu na zarazne ili kontagiozne bolesti kopitara na njezinom području, osobito bolesti koje su na popisu OIE i navedene u Dodatku A ovoga Pravilnika;

(f) jamstva koja daje treća zemlja za izravno obavještavanje Republike Hrvatske i Europske komisije i to:

– u roku od 24 sata o potvrđenom slučaju zarazne bolesti kopitara iz Dodatka A ovoga Pravilnika i svakoj promjeni programa cijepljenja u odnosu na navedene bolesti,

– unutar odgovarajućeg razdoblja, o bilo kojoj predloženoj mjeri u odnosu na nacionalna sanitarna pravila za kopitare, osobito za uvoz kopitara,

– u redovitim intervalima, o statusu zdravlja kopitara na njenom području;

(g) o ranije poduzetom uvozu živih kopitara iz treće zemlje i rezultatima provedenih uvoznih kontrola;

(h) rezultate inspekcija provedenih od strane Europske komisije i/ili revizije (engl. audit) provedene u trećoj zemlji, osobito rezultate procjene nadležnog tijela ili, na zahtjev Europske komisije, izvješće dostavljeno od odnosnog nadležnog tijela o provedenim inspekcijama;

(i) važeće propise o prevenciji i kontroli zaraznih ili kontagioznih bolesti životinja koji su na snazi u trećoj zemlji i njihova primjena, uključujući pravila za uvoz kopitara iz trećih zemalja.

Članak 13.

Uvoz kopitara iz trećih zemalja dozvoljen je ako dolaze iz zemlje:

(a) slobodne od konjske kuge,

(b) koja je u posljednje dvije godine slobodna od venecuelanskog encefalomijelitisa,

(c) koja je u posljednjih šest mjeseci slobodna od durine i maleusa.

Članak 14.

Prije utovara kopitari namijenjeni otpremi u Republiku Hrvatsku moraju neprekidno boraviti na području ili dijelu područja treće zemlje sukladno popisu iz članka 12. ovoga Pravilnika kroz razdoblje koje se utvrđuje u skladu s člankom 15. ovoga Pravilnika. Kopitari moraju dolaziti s gospodarstva koje je pod veterinarskim nadzorom.

Članak 15.

Uvoz kopitara sa područja ili dijela područja trećih zemalja dozvoljen je samo uz uvjete iz članka 13. ovoga Pravilnika i ukoliko:

(a) kopitari ispunjavaju zahtjeve zdravlja životinja propisane za određenu vrstu i kategoriju kopitara u skladu s člancima 4. i 5. ovoga Pravilnika;

(b) se radi o trećoj zemlji koja najmanje posljednjih šest mjeseci nije slobodna od vezikularnog stomatitisa ili virusnog arteritisa, uz uvjet da kopitari udovoljavaju sljedećim zahtjevima:

– moraju dolaziti s gospodarstva na kojemu u posljednjih šest mjeseci nije bilo pojave vezikularnog stomatitisa i moraju negativno reagirati na serološki test prije otpreme;

– u slučaju pojave virusnog arteritisa, muška grla kopitara, moraju negativno reagirati na serološki test ili na test izolacije virusa odnosno drugi priznati test koji jamči da su životinje slobodne od virusa.

Članak 16.

1) Kopitari moraju biti identificirani u skladu s člankom 4. stavkom 4. ovoga Pravilnika i mora ih pratiti certifikat koji je izdao službeni veterinar treće zemlje iz koje se izvozi. Certifikat mora:

(a) biti izdan na dan utovara životinja u svrhu slanja na odredište u Republici Hrvatskoj ili, ako se radi o registriranim konjima, zadnji radni dan prije utovara,

(b) biti napisan barem na hrvatskom jeziku i jeziku države članice u koju je kopitar uvezen,

(c) pratiti životinje u izvorniku,

(d) potvrđivati da životinje udovoljavaju zahtjevima propisanim ovim Pravilnikom,

(e) biti napisan na jednom listu papira,

(f) biti izdan za jednog primatelja ili, ako se radi o životinjama za klanje, za pošiljku, pod uvjetom da su životinje označene i identificirane u skladu s propisanim.

2) U slučaju postupanja iz stavka 1. ovoga članka nadležno tijelo obavještava Europsku komisiju.

Članak 17.

1) Nadležno tijelo i veterinarski stručnjaci Europske komisije obavljaju preglede na licu mjesta radi utvrđivanja postupanja u skladu s odredbama ovoga Pravilnika i osobito u skladu s člankom 12. stavkom 2. ovoga Pravilnika.

2) Troškove pregleda iz stavka 1. ovoga Pravilnika podmiruje Europska komisija.

Članak 18.

1) Odmah po prispijeću u Republiku Hrvatsku, kopitari namijenjeni za klanje moraju biti otpremljeni u klaonicu, bilo direktno ili nakon sajma ili sabirnog centra, i u skladu sa zahtjevima zdravlja životinja biti zaklani u razdoblju u skladu s člankom 15. ovoga Pravilnika.

2) Nadležno tijelo može, uzimajući u obzir zdravlje životinja, odrediti klaonice namijenjene klanju kopitara iz stavka 1. ovoga članka.

Članak 19.

Odredbe posebnog propisa[8] primjenjuje se na uvjete propisane Poglavljem III. ovoga Pravilnika.

Članak 20

Dodatak A do D tiskani su u prilogu ovoga Pravilnika i čine njegov sastavni dio.

Članak 21.

Posebni propisi iz:

– članka 2. točke (c) i članka 4. stavka 4. ovoga Pravilnika bit će donesen do 30. rujna 2009. godine,

– članka 7. stavka 1. ovoga Pravilnika bit će donesen do 31. prosinca 2008. godine,

– članka 19. ovoga Pravilnika bit će donesen do 30. lipnja 2009. godine.

Članak 22.

Danom stupanja na snagu ovoga Pravilnika prestaje važiti Pravilnik o veterinarsko-zdravstvenim uvjetima za stavljanje kopitara u promet (»Narodne novine«, broj 88/05).

Članak 23.

1) Ovaj Pravilnik stupa na snagu osmoga dana od dana objave u »Narodnim novinama«.

2) Iznimno od stavka 1. ovoga članka odredbe članka 3. stavka 3., članka 4. stavka 7., članka 6. stavka 2., članka 8. stavka 1. alineje druge, članka 16. stavka 2. i Dodatka C ovoga Pravilnika stupaju na snagu danom pristupanja Republike Hrvatske u članstvo Europske unije.

Klasa: 011-02/08-01/16

Urbroj: 525-11-08-1

Zagreb, 11. prosinca 2008.

Ministar
mr. sc. Božidar Pankretić, v. r.

DODATAK A

BOLESTI KOPITARA KOJE SE OBVEZNO PRIJAVLJUJU

Obvezno se prijavljuju sljedeće bolesti kopitara:

– durina,

– maleus,

– encefalomijelitis konja (svi tipovi uključujući i venecuelanski encefalomijelitis),

– infekciozna anemija kopitara,

– bjesnoća,

– bedrenica,

– konjska kuga,

– vezikularni stomatitis.

DODATAK B

PODACI O ZDRAVLJU(a)

Putovnica br. __________

1. Ja, dolje potpisani, potvrđujem(b) da prethodno opisani kopitari ispunjavaju sljedeće uvjete:

(a) danas su pregledani i nisu utvrđeni nikakvi klinički znakovi bolesti;

(b) nisu namijenjeni klanju u skladu s nacionalnim programom iskorjenjivanja zaraznih ili kontagioznih bolesti;

(c) ne dolaze s područja ili dijela područja države članice/treće zemlje koja je pod zabranom zbog konjske kuge(c), ili

– dolaze s područja ili dijela područja države članice koja je bila predmet zabrane zbog razloga zdravlja životinja i da su u karantenskom objektu.……….. podvrgnuti, s negativnim rezultatima testova navedenim u Dodatku C ovoga Pravilnika

____________ između ____________ i ____________(c);

– nisu cijepljeni protiv konjske kuge, ili su bili cijepljeni protiv konjske kuge dana ____________(c) (d);

(d) ne potječu s gospodarstva koje je pod zabranom zbog razloga zdravlja životinja, niti su bili u dodiru s kopitarima s gospodarstva koje je pod zabranom zbog razloga zdravlja životinja:

– tijekom šest mjeseci u slučaju kopitara sumnjivih da su bili u dodiru s durinom, počevši od dana zadnjeg stvarnog ili mogućeg dodira s bolesnom životinjom. Kada se radi o pastuhu, zabrana se primjenjuje dok životinja nije kastrirana,

– tijekom šest mjeseci u slučaju maleusa ili encefalomijelitisa konja, počevši od dana kada su životinje zaražene navedenim bolestima zaklane,

– u slučaju infekciozne anemije kopitara, do dana kada su zaražene životinje zaklane, a preostale životinje su negativno reagirale na dva Coggins testa provedena u razmaku od tri mjeseca,

– tijekom šest mjeseci od posljednjeg slučaja, u slučaju vezikularnog stomatitisa,

– u slučaju bjesnoće, tijekom jednog mjeseca od posljednjeg slučaja,

– u slučaju bedrenice, tijekom 15 dana od posljednjeg slučaja,

– ukoliko su sve vrste životinja prijemljive na bolest smještene na gospodarstvu zaklane i objekti dezinficirani, razdoblje zabrane je 30 dana, počevši od dana kada su životinje uništene i objekti dezinficirani, osim u slučaju bedrenice kada je razdoblje zabrane 15 dana.

(e) koliko mi je poznato, životinja nije bila u dodiru s kopitarima oboljelim od zaraznih ili kontagioznih bolesti u razdoblju 15 dana prije davanja ove izjave.

1) (f) stanje životinja utvrđeno u trenutku pregleda dopušta njihov prijevoz na planiranom putovanju u skladu s odredbama Pravilnika o zaštiti životinja tijekom prijevoza i s prijevozom povezanih postupaka (»Narodne novine«, broj 7/07)(e)[9]

Datum	Mjesto	Pečat i potpis službenog veterinara 1)
1) Zvanje i ime velikim tiskanim slovima.

(a) ova informacija nije potrebna ukoliko je zaključen bilateralni ugovor u skladu s člankom 6. Pravilnika o veterinarskim uvjetima za premještanje kopitara i uvoz iz trećih zemalja

(b) važi 10 dana

(c) obrisati po potrebi

(d) datum cijepljenja mora biti upisan u putovnicu

(e) izjava ne oslobađa prijevoznike od obveza u skladu s važećim propisima, osobito u odnosu na sposobnost životinja koje se prevoze

DODATAK C

CERTIFIKAT /HEALTH CERTIFICATE
ZA PROMET IZME�?U DRŽAVA ČLANICA EUROPSKE UNIJE /
For trade between Member States
KOPITARI / EQUIDAE
grb/emblem

DRŽAVA/ STATE........................................ Nadležno tijelo/ Competent authority.......................................

Broj: / No..........................................

Država članica otpreme: / Member State of dispatch:…..………….

Nadležno ministarstvo: / Ministry responsible:……………………..

Lokalno nadležno tijelo: / Territorial Department responsible:

I. Broj kopitara: / Number of equidae: ………………...............……

II. Identifikacija kopitara: / identification of equidae:

Broj kopitara (1) / Number of equidae (1)	Vrsta: konj, magarac, mula, mazga/Species: horse, ass, mule, hinny	Pasmina, dob, spol/Breed, Age, Sex	Metoda identifikacije i identifikacija (2) / Method of identification and identification (2)
(1) U slučaju životinja namijenjenih klanju, vrsta posebne oznake. / In the case of animals for slaughter, nature of special mark. (2) Putovnica koja identificira kopitara može biti priložena ovom certifikatu za potvrdu navedenog broja. / A passport identifying the equine animal may be attached to this certificate provided that its number is stated.

III. Podrijetlo i odredište životinje/a: / Origin and destination of animal/s:

Životinja/e se upućuje/u: / The animal/s is/are to be sent:

Iz/from:................................................................
(mjesto izvoza / place of export)

u/to:..........................................................................................................
(Država članica i mjesto odredišta / Member State and place of destination)

Ime i adresa pošiljatelja: / Name and address of consignor:

…………………………………………

Ime i adresa primatelja: / Name and address of consignee:

…………………………………………

IV. Podaci o zdravlju a)/ Health information a)

Putovnica br. ________________ Passport No_____________

Ja, dolje potpisani, potvrđujem da prethodno opisan/i kopitar/i ispunjava/ju sljedeće uvjete: / I, the undersigned certify that the equine animal/s described above meet/s the following requirements:

1) danas je/su pregledan/i i nisu utvrđeni nikakvi klinički znakovi bolesti; / it/they has/have been examined today and show/s no clinical sign of disease;

2) nije/nisu namijenjen/i klanju u skladu s nacionalnim programom suzbijanja kontagioznih ili zaraznih bolesti; / it/they is/are not intended for slaughter under a national programme of contagious or infectious disease eradication;

3) ne dolazi/e s područja ili dijela područja države članice/treće zemlje koja je pod zabranom zbog konjske kuge, ili / it/they do/does not come from the territory or part of the territory of a Member State/third country which is the subject of restrictions for reasons of African horse sickness, or/ili

– dolazi/e s područja ili dijela područja države članice koja je bila predmet zabrana zbog konjske kuge i imala/imali je/su zadovoljavajuće rezultate na testove navedene u stavku 3. članka 5. Direktive 90/426/EEZ u karanteni u _________________između________________. i ________________b); / it/they come/s from the territory or part of the territory of a Member State which was subject to prohibition for animal health reasons and has undergone, with satisfactory results, the test provided for in Article 5(3) of Directive 90/426/EEC in the quarantine station of _________________between________________ and ________________b);

– nije/nisu cijepljen/i protiv konjske kuge, ili je/su bila/bili cijepljeni protiv konjske kuge dana ________________b); / it/they is/are not vaccinated against African horse sickness, or it/they was/were vaccinated against African horse sickness on ________________b);

4) ne potječe/u s gospodarstva koje je pod zabranom zbog razloga o zdravlju životinja, niti je/su bila/bili u dodiru s kopitarima s gospodarstva koje je pod zabranom zbog razloga o zdravlju životinja: / it/they do/does not come from a holding which was subject to prohibition for animal health reasons nor had contact with equidae from a holding which was subject to prohibition for animal health reasons:

– tijekom šest mjeseci u slučaju kopitara sumnjivih na durinu, počevši od dana stvarnog ili mogućeg dodira s bolesnom životinjom. Međutim, kada se radi o pastuhu, zabrana se primjenjuje dok životinja nije kastrirana; / during six months in the case of equidae suspected of having contracted dourine, beginning on the date of the last actual or possible contact with a sick animal. However, in the case of a stallion, the prohibition shall apply until the animal is castrated;

– tijekom šest mjeseci u slučaju maleusa ili encefalomijelitisa konja, počevši od dana kada su životinje zaražene tim bolestima zaklane; / during six months in the case of glanders or equine encephalomyelitis, beginning on the day on which the equidae suffering from the disease in question are slaughtered;

– u slučaju infekciozne anemije, do dana kada su zaražene životinje zaklane a preostale životinje su negativno reagirale nakon dva Cogginsova testa provedena u razmaku od tri mjeseca; / in the case of infectious anemia, until the date on which, the infected animals having been slaughtered, the remaining animals have shown a negative reaction to two Coggins tests carried out three months apart;

– tijekom šest mjeseci od posljednjeg zabilježenog slučaja u slučaju vezikularnog stomatitisa; / during six months from the last case, in the case if vesicular stomatitis;

– u slučaju bjesnoće, tijekom jednog mjeseca od posljednjeg zabilježenog slučaja; / during one month from the last case, in the case of rabies;

– u slučaju bedrenice, tijekom 15 dana od posljednjeg zabilježenog slučaja; / during 15 days from the last case, in the case of anthrax;

– ukoliko su sve vrste životinja osjetljive na bolest smještene na gospodarstvu zaklane i objekti dezinficirani, razdoblje zabrane je 30 dana, počevši od dana kada su životinje uništene i objekti dezinficirani, osim u slučaju bedrenice kada je razdoblje zabrane 15 dana; / if all the animals of species susceptible to the disease located on the holding have been slaughtered and the premises disinfected during 30 days, beginning on the day on which the animals were destroyed and the premises disinfected, except in the case of anthrax,where the period of prohibition is 15 days;

5) koliko mi je poznato, životinja/e nije/nisu bila/bile u dodiru s kopitarima oboljelim od neke kontagiozne ili zarazne bolesti u razdoblju 15 dana prije ove izjave; / to the best of my knowledge, it/they has/have not been in contact with equidae suffering from an infectious or contagious disease in the 15 days prior to this declaration;

(2) 6) stanje životinje/a utvrđeno u trenutku pregleda dopušta njen/njihov prijevoz na planiranom putovanju u skladu s odredbama Direktive 91/628/EEC./ at the time of inspection it/they was/were fit to be transported on the intended journey in accordance with the provisions of Directive 91/628/EEZc.

V. Ovaj certifikat vrijedi 10 dana / This certificate is valid for 10 days.

Datum /Date…………………. Mjesto/Place………….......………..

Pečat /Stamp

…………………………………………………….

Potpis/Signature

Zvanje i ime velikim tiskanim slovima / Name in capital letters and capacity of signing veterinarian.

Opaske/ Note

a) Ovaj podatak nije potreban ukoliko postoji bilateralni ugovor u skladu s člankom 6. Direktive 90/426/EEC. / This information is not required where there is a bilateral agreement in accordance with Article 6 of Directive 90/426/EEC.

b) Obrisati po potrebi/ Delete whichever does not apply

c) Izjava ne osobađa prijevoznike od obveze u skladu s važećim propisima Zajednice osobito u odnosu na sposobnost životinja koje se prevoze. / This statement does not exempt transporters from their obligations in accordance with Community provisions in force in particular regarding the fitness of animals to be transported.

DODATAK D

DIJAGNOSTIKA KONJSKE KUGE

Reagensi za dolje opisane imunoenzimne testove (ELISA) mogu se dobiti u referentnom laboratoriju Europske zajednice ili OIE-ovim referentnim laboratorijima za dijagnosticiranje konjske kuge.

1. KOMPETITIVNI TEST ELISA ZA OTKRIVANJE ANTITIJELA ZA VIRUS KONJSKE KUGE (VKK) (PROPISANI TEST)

Kompetitivni ELISA test upotrebljava se za otkrivanje specifičnih antitijela za VKK u serumu bilo koje vrste kopitara. Serum zamorca protiv VKK (u daljnjem tekstu �?antiserum zamorca’) je poliklonski imuni serum širokog spektra koji je specifičan i kojim je moguće prepoznati sve poznate serotipove virusa konjske kuge.

Test se temelji na onemogućavanju vezivanja antigena VKK i antiseruma zamorca dodavanjem uzorka ispitivanog seruma ukoliko je pozitivan. Antitijela za VKK u uzorku ispitivanog seruma pokazuju veći afinitet prema antigenima VKK, te će se smanjiti vezivanje antiseruma zamorca za iste, što rezultira smanjenjem očekivane obojenosti (nakon dodavanja enzimom označenih anti-zamorčevih antitijela i supstrata). Serumi se mogu testirati pri jednom razrjeđenju od 1: 5 (metoda pretraživanja seruma pri jednom razrjeđenju) ili se mogu titrirati (metoda titracije seruma) kako bi se dobile završne točke razrjeđenja.

Vrijednosti inhibicije veće od 50 % mogu se smatrati pozitivnim.

Dolje opisani protokol ispitivanja primjenjuje se u Regionalnome referentnom laboratoriju za konjsku kugu u Pirbrightu, u Ujedinjenom Kraljevstvu.

1.1. Opis testa

1.1.1. Pripremanje plitica

1.1.1.1. Na ELISA plitice nanesite antigen VKK koji je ekstrahiran iz zaraženih staničnih kultura i razrijeđen u karbonatnom/ bikarbonatnom puferu, pH 9,6. Inkubirajte ELISA plitice preko noći na 4 °C.

1.1.1.2. Isperite plitice tri puta tako što ćete puniti i prazniti jažice fosfatnim puferom (PBS), pH 7,2 do 7,4 pH, te ih osušite na upijajućem papiru.

1.1.2. Kontrolne jažice

1.1.2.1. Titrirajte pozitivne kontrolne serume u serijama dvostrukog razrjeđenja, od 1: 5 do 1: 640, duž stupca 1 u blokirajućem puferu (PBS koji sadrži 0,05 % (v/v)Tween-20, 5,0 % (w/v) obranog mlijeka u prahu (Cadbury’s Marvel TM) i 1 % (v/v) goveđeg seruma) kako biste dobili konačni volumen od 50 µl po jažici.

1.1.2.2. U jažice A i B u stupcu 2 dodajte 50 µl negativnog kontrolnog seruma u razrjeđenju od 1: 5 (10 µl seruma + 40 µl blokirajućeg pufera).

1.1.2.3. U jažice C i D u stupcu 2 dodajte po 100 µl blokirajućeg pufera (slijepa kontrola).

1.1.2.4. U jažice E, F, G i H u stupcu 2 dodajte po 50 µl blokirajućeg pufera (kontrolni serum zamorca).

1.1.3. Ispitivanje seruma pri jednom razrjeđenju

1.1.3.1. U dvije jažice u stupcima 3 do 12 dodajte svaki ispitivani serum razrijeđen u blokirajućem puferu u omjeru 1:5 (10 µl seruma + 40 µl blokirajućeg pufera).

ili

1.1.4 Metoda titracije seruma

1.1.4.1 Pripremite serije dvostrukog razrjeđenja svakog pretraživanog uzorka (1: 5 do 1: 640) u blokirajućem puferu u osam jažica svakog pojedinog stupca (3 do 12).

potom

1.1.5 U sve jažice na ELISA plitici, osim u jažice slijepe kontrole, dodajte po 50 µl antiseruma zamorca, prethodno razrijeđenog u blokirajućem puferu (sada sve jažice sadrže konačni volumen od 100 µl).

1.1.5.1 Inkubirajte 1 sat na 37 °C na rotacijskoj tresilici.

1.1.5.2 Plitice isperite tri puta te osušite kao prije.

1.1.5.3 U svaku jažicu dodajte 50 µl kunićjeg anti-zamorčevog konjugata obilježenog peroksidazom iz hrena (HRP), prethodno razrijeđenog u blokirajućem puferu.

1.1.5.4. Inkubirajte 1 sat na 37 °C na rotacijskoj tresilici.

1.1.5.5. Plitice isperite tri puta te osušite kao prije.

1.1.6 Kromogen

Pripremite otopinu kromogena OPD (OPD = orto-fenildiamin) prema uputama proizvođača (0,4 mg/ml u sterilnoj destiliranoj vodi) neposredno prije uporabe. Dodajte supstrat (vodikov peroksid = H₂O₂) kako biste dobili konačnu koncentraciju od 0,05 % (v/v)(1: 2000 30 %-tne otopine H₂O₂).

U svaku jažicu dodajte 50 µl otopine OPD i ostavite plitice 10 minuta na temperaturi okoline. Zaustavite reakciju dodajući u svaku jažicu po 50 µl 1M sumporne kiseline (H₂SO₄).

1.1.7 Očitavanje rezultata

Rezultat očitajte spektrofotometrijski na 492 nm.

1.2 Izražavanje rezultata

1.2.1 Koristeći računalni programski paket ispišite vrijednosti optičke gustoće (OD) te postotak inhibicije (PI) za pretraživane i kontrolne serume temeljene na srednjoj vrijednosti koja je zabilježena u četiri jažice s kontrolnim serumom zamorca.

Na temelju podataka izraženih kao OD i PI vrijednosti određuje se je li uspješnost testa bila unutar prihvatljivih granica. Gornje kontrolne granice (GKG) i donje kontrolne granice (DKG) za kontrolni serum zamorca nalaze se između OD vrijednosti 1,4 odnosno 0,4. Titar završne točke pozitivne kontrole na temelju 50 % PI treba biti 1:240 (u rasponu od 1:120 do 1:480).

Treba odbaciti svaku pliticu koja ne ispunjava gore navedene kriterije. Međutim, mogu se prihvatiti negativni ispitivani uzroci ako je titar pozitivnog kontrolnog seruma veći od 1:480, a ispitivani uzorci su još uvijek negativni.

Jažice s negativnim kontrolnim serumom u duplikatu i jažice za slijepu kontrolu u duplikatu trebaju doseći PI vrijednosti između + 25 % i – 25 %, odnosno između + 95 % i + 105 %. Ukoliko vrijednosti nisu unutar ovih granica, ne znači da je plitica neprihvatljiva nego upućuje na to da se razvija pozadinska boja.

1.2.2 Dijagnostički prag (granična vrijednost) za pretraživane serume je 50 % (PI 50 %). Uzorci čije su PI vrijednosti veće od 50 % ocjenjuju se kao pozitivni. Uzorci čije su PI vrijednosti manje od 50 % ocjenjuju se kao negativni.

Uzorci čije su PI vrijednosti iznad i ispod praga kod jažica u duplikatu smatraju se sumnjivim. Ti se uzorci mogu ponovo ispitati testom s jednim razrjeđenjem ili titracijom. Pozitivni se uzorci mogu također titrirati kako bi se utvrdio njihov titar.

Prikazivanje rezultata testa s jednim razrjeđenjem

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	+ kont.	Pretraživani serumi
A	1:5	– kont.	31	32	33	34	35	36	37	38	39	40
B	1:10	– kont.	31	32	33	34	35	36	37	38	39	40
C	1:20	Slijepa kont.
D	1:40	Slijepa kont.
E	1:80	SZ kont.
F	1:160	SZ kont.
G	1:320	SZ kont.	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
H	1:640	SZ kont.	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
– kont. = negativna kontrola. + kont. = pozitivna kontrola. SZ kont. = kontrolni serum zamorca.

Pretraživani serum

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

+ kont.

Pretraživani serum

A

1:5

–kont.

1:5

1:5

B

1:10

–kont.

1:10

1:10

C

1:20

Slijepa kont.

1:20

1:20

D

1:40

Slijepa kont.

1:40

1:40

E

1:80

SZ kont.

1:80

1:80

F

1:160

SZ kont.

1:160

1:160

G

1:320

SZ kont.

1:320

1:320

H

1:640

SZ kont.

1:640

1:640

– kont. = negativna kontrola. + kont. = pozitivna kontrola. SZ kont. = kontrolni serum zamorca.

2. INDIREKTNI TEST ELISA ZA OTKRIVANJE ANTITIJELA ZA VIRUS KONJSKE KUGE (VKK) (PROPISANI TEST)

Test koji se opisuje u daljnjem tekstu u skladu je s opisom testa iz poglavlja 2.1.11. OIE-ovog Priručnika o normama za dijagnostičke testove i cjepiva, četvrto izdanje, 2000.

Rekombinantni protein VP7 koristio se kao antigen za otkrivanje antitijela usmjerenih protiv virusa konjske kuge, uz visoki indeks osjetljivosti i specifičnosti. Njegove prednosti su i u tome što je stabilan i nije infektivan.

2.1 Opis testa

2.1.1 Čvrsta faza

2.1.1.1 Na ELISA plitice nanesite VKK-4 VP7 razrijeđen u karbonatnom/ bikarbonatnom puferu, pH 9,6. Inkubirajte plitice preko noći na 4 °C.

2.1.1.2 Plitice isperite pet puta destiliranom vodom koja sadrži 0,01 % (v/v) Tween 20 (otopina za ispiranje).

Lagano pritisnite plitice na upijajući materijal (staničevinu ili celuloznu vatu) kako bi se odstranili ostaci otopine za ispiranje.

2.1.1.3 Plitice blokirajte stavljajući u svaku jažicu 200 µl fosfatnog pufera (PBS)+ 5% (w/v) obranog mlijeka (Nestlé Dry Skim Milk TM) i ostavite 1 sat na 37 °C.

2.1.1.4 Uklonite blokirajuću otopinu i lagano pritisnite plitice na upijajući materijal.

2.1.2 Uzorci za pretraživanje

2.1.2.1 Uzorci seruma koji se pretražuju te pozitivni i negativni kontrolni serumi razrjeđuju se 1:25 u PBS + 5% (w/v) obranog mlijeka + 0,05% (v/v)Tween 20, 100 µl po jažici. Inkubirajte 1 sat na 37 °C.

Za titraciju pripremite serije dvostrukog razrjeđenja od 1:25 (100 µl po jažici), koristeći jedan stupac plitice za svaki serum, te isto učinite s pozitivnim i negativnim kontrolama. Inkubirajte 1 sat na 37 °C.

2.1.2.2 Isperite plitice kako je opisano pod 2.1.1.2.

2.1.3 Konjugat

2.1.3.1 U svaku jažicu stavite po 100 µl anti-konjskih gamaglobulina konjugiranih peroksidazom iz hrena (HRP), razrijeđenih u PBS-u + 5% mlijeka + 0,05% Tween 20, pH 7,2. Inkubirajte 1 sat na 37 °C.

2.1.3.2 Isperite plitice kako je opisano pod 2.1.1.2.

2.1.4 Kromogen/Supstrat

2.1.4.1 U svaku jažicu dodajte 200 µl otopine kromogena/supstrata (10 ml 80,6 mM DMAB (dimetilaminobenzaldehid)+ 10 ml 1,56 mM MBTH (3-metil-2-benzo -tiazolin hidrazon hidroklorid)+ 5 µl H₂O₂)

Razvijanje boje zaustavite dodavanjem 50 µl 3N H₂SO₄ nakon približno 5 do 10 minuta (prije nego se počne bojiti negativna kontrola).

Mogu se upotrebljavati i drugi kromogeni kao što su ABTS (2,2’-azino-bis -[3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina]), TMB (tetrametil benzidin), ili OPD (orto-fenildiamin).

2.1.4.2 Plitice očitajte na 600 nm (ili 620 nm).

2.2 Tumačenje rezultata

2.2.1 Izračunajte graničnu vrijednost tako što ćete vrijednosti negativne kontrole dodati 0,6 (0,6 je standardna devijacija dobivena sa skupinom od 30 negativnih seruma).

2.2.2 Pretraživani uzorci koji daju vrijednosti apsorbancije niže od granične vrijednosti smatraju se negativnim.

2.2.3 Pretraživani uzorci koji daju vrijednosti apsorbancije veće od granične vrijednosti + 0,15 smatraju se pozitivnim.

2.2.4 Pretraživani uzorci koji daju vrijednosti apsorbancije između pozitivnih i negativnih sumnjivi su te se mora primijeniti dodatna metoda kako bi se rezultat potvrdio.

3. BLOKIRAJUĆI TEST ELISA ZA OTKRIVANJEANTITIJELA ZA VIRUS KONJSKE KUGE (VKK) (PROPISANI TEST)

Blokirajući test ELISA namijenjen je otkrivanju specifičnihantitijela za VKK u serumima svih vrsta prijemljivih na bolest. VP7 je glavni, antigenski, virusni protein VKK-a, i sačuvan je u devet serotipova. Budući da je monoklonalno antitijelo (Mat) usmjereno i protiv VP7, test pruža visoku razinu osjetljivosti i specifičnosti.

Nadalje, rekombinantni VP7 antigen je potpuno neškodljiv te stoga jamči visoki stupanj sigurnosti.

Test se temelji na prekidanju reakcije između rekombinantnog VP7, kao antigena vezanog na ELISA pliticu, i konjugiranog Mat specifičnog za VP7. Antitijela u pretraživanim serumima blokirat će reakciju između antigena Mat, što će dovesto do smanjenja obojenja.

Test koji se opisuje u daljnjem tekstu izvodi se u Referentnom laboratoriju Europske zajednice za konjsku kugu u Algeteu u Španjolskoj.

3.1 Opis testa

3.1.1 ELISA plitice

3.1.1.1 Na ELISA plitice nanesite rekombinantni VKK-4 VP7 razrijeđen u karbonatnom/ bikarbonatnom puferu, pH 9,6. Inkubirajte ELISA plitice preko noći na 4 °C.

3.1.1.2 Plitice isperite pet puta fosfatnim puferom (PBS) koji sadrži 0,05% (v/v)Tween 20 (PBST).

3.1.1.3. Stabilizirajte plitice stabilizirajućom otopinom (kako bi se omogućilo dugotrajno čuvanje na 4 °C bez gubitka aktivnosti) te ih osušite na upijajućem materijalu.

3.1.2 Pretraživani uzorci i kontrole

3.1.2.1 Za pregled: pretraživane serume i kontrole izravno na plitici razrijedite 1:10 u PBST-u kako biste u svakoj jažici dobili konačni volumen od 100 µl. Inkubirajte 1 sat na 37 °C.

3.1.2.2 Za titraciju: pripremite seriju dvostrukog razrjeđenja pretraživanih seruma i pozitivnih kontrola (100 µl/jažica) od 1:10 do 1:1280 u osam jažica.

Negativna se kontrola testira pri razrjeđenju 1:1

3.1.3 Konjugat

U svaku jažicu dodajte 50 µl prethodno razrijeđenih Mat (monoklonalna antitijela specifična za VP7) konjugiranih peroksidazom iz hrena te lagano promiješajte kako biste osigurali homogenost. Inkubirajte 30 minuta na 37 °C.

3.1.4 Plitice pet puta isperite PBST-om te osušite kao ranije.

3.1.5 Kromogen/Supstrat

U svaku jažicu dodajte 100 µl otopine kromogena/supstrata (1 ml ABTS (2,2’-azino-bis -[3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina]) 5 mg/ml + 9 ml supstratnog pufera (0,1 M fosfat-citratni pufer s pH 4 koji sadrži 0,03% H₂O₂] te inkubirajte 10 minuta na sobnoj temperaturi.

Razvijanje boje se zaustavlja tako da se u svaku jažicu doda 100 µl 2%-nog (w/v) SDS-a (natrij dodecil sulfat).

3.1.6 Očitavanje rezultata

Rezultate očitajte pri 405 nm u ELISA čitaču.

3.2 Tumačenje rezultata

3.2.1 Validacija testa

Test je valjan ako je optička gustoća (OD) negativne kontrole (NK) veća od 1,0 i ako je OD pozitivne kontrole (PK) manji od 0,2.

3.2.2 Izračunavanje granične vrijednosti

Pozitivna granična vrijednost = NK – ((NK – PK)x 0,3)

Negativna granična vrijednost = NK – ((NK – PK)x 0,2)

NK je optička gustoća negativne kontrole, a PK je optička gustoća pozitivne kontrole.

3.2.3 Tumačenje rezultata.

Uzroke kod kojih je OD manji od pozitivne granične vrijednosti treba smatrati pozitivnim na antitijela za VKK.

Uzorke kod kojih je OD veći od negativne granične vrijednosti treba smatrati negativnim na antitijela za VKK.

Uzroke kod kojih je OD između te dvije vrijednosti treba smatrati sumnjivim te bi se kod tih životinja trebalo ponovo obaviti uzorkovanje nakon dva do tri tjedna.